Leica Biosystems HER2 FISH System - 30 Test - Manual (Página 7)

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Leica Biosystems Leica HER2 FISH System - 30 Test Instrucciones de uso TA9217 ES-CE-Rev_D 08/04/2013
• Horno de secado (capaz de mantener 60 °C)
• Microscopio de fluorescencia (objetivo de 60–100x) con una fuente de luz adecuada.
Registre el número de horas que se ha estado utilizando la bombilla y sustitúyala antes
de que supere el tiempo recomendado. Asegúrese de que la lámpara está correctamente
alineada.
• Juego de filtros de fluorescencia adecuados (SpectrumOrange ™ – pico de excitación a
559 nm, pico de emisión a 588 nm, SpectrumGreen ™ – pico de excitación a 497 nm, pico
de emisión a 524 nm y DAPI – pico de excitación a 367 nm, pico de emisión a 452 nm).
Los juegos de filtros de microscopía de fluorescencia multibanda optimizados para el uso
con el Leica HER2 FISH System - 30 Test están disponibles para la mayoría de modelos
de microscopio. Los juegos de filtros recomendados para el Leica HER2 FISH System -
30 Test son el de paso de banda dual DAPI/9-naranja, el de paso de banda dual DAPI/
verde, el de paso de banda dual verde/naranja (V.2) y el de paso de banda triple DAPI/
verde/naranja (V.2).
C. Metodología
• Antes de seguir esta metodología, los usuarios deben recibir la formación adecuada
sobre la técnica de fluorescencia in situ automatizada.
• Cada corte de prueba teñido con LSI HER2/CEP17 Dual Probe permite el mismo análisis
celular de las señales de HER2 y del cromosoma centromérico 17. La subsiguiente
proporción entre las señales de HER2 y las del cromosoma 17 permitirá asignar un valor
cuantitativo a la muestra, que indicará a su vez un resultado negativo (no amplificado) o
positivo (amplificado). Los resultados equívocos (dudosos) (1.8-2.2) deben interpretarse
con precaución. Recuente 20 núcleos adicionales y vuelva a calcular la proporción.
D. Pretratamiento enzimático BOND
Antes de la tinción, diluya el Leica BOND Enzyme Concentrate 2 suministrado con una
dilución 1:300 con el Leica BOND Enzyme Diluent suministrado en uno de los Leica BOND
Open Containers disponibles. Por ejemplo, para teñir 10 portaobjetos, prepare 3 ml de
solución enzimática de trabajo diluyendo 10 µl de Leica BOND Enzyme Concentrate 2 en
2990 µl de Leica BOND Enzyme Diluent. Se recomienda preparar el enzima justo antes de
cada ciclo de tinción y que se utilice un volumen mínimo de 900 µl por ciclo.
E. Protocolo de tinción predeterminado
Se recomienda que el Leica HER2 FISH System - 30 Test se utilice con el protocolo de
tinción predeterminado recomendado que se muestra a continuación en la tabla 2.
Tipo de protocolo Nombre del protocolo
Tinción *FISH Protocol A
Preparación *Dewax
HIER *HIER 25 min with ER1 (97)
Enzima *Enzyme 5 for 25 min
Desnaturalización *D10
Hibridación *ISH Hybridization (12Hr)