Leica Biosystems HER2 FISH System - 30 Test - Manual (Página 10)

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Leica Biosystems Leica HER2 FISH System - 30 Test Instrucciones de uso TA9217 ES-CE-Rev_D 08/04/2013
Evaluación y enumeración de señales
Para evaluar la calidad de la señal y enumerar las señales de HER2 y de CEP17, siga este
proceso:
1. Evaluación de la calidad del portaobjetos
Evalúe la calidad del portaobjetos mediante los siguientes criterios:
• Intensidad de la señal de la sonda: las señales deben ser brillantes y
fáciles de evaluar. Las señales deben encontrarse con formas brillantes,
ovales y compactas o bien con formas difusas y ovales.
• Fondo: el fondo debe estar relativamente libre de partículas fluorescentes
y aparecer negro u oscuro.
Consulte la guía de resolución de problemas (tabla 6) si alguna de las
funciones anteriores no son satisfactorias y vuelva a repetir el ensayo, si
es necesario.
2. Detección de las señales objetivo
Asegúrese de que se utilizan los filtros correctos para el análisis:
• Vista general del tejido: las señales de hibridación solo deben
enumerarse en las células tumorales invasivas. Generalmente, las células
tumorales pueden distinguirse de las células normales por el tamaño:
suelen ser más grandes que las células normales, los linfocitos y las
células epiteliales. Identifique y seleccione las zonas objetivo, gracias a la
tinción H&E y marque estas zonas en el cubreobjetos, después de realizar
el ensayo FISH.
• Profundidad del enfoque: ajuste la profundidad del enfoque para
determinar la profundidad del plano de enfoque y familiarizarse con la
forma y el tamaño de las señales objetivo y de ruido (detritos).
1. Evaluación
de la
calidad del
portaobjetos
- Intensidad de la
señal de la sonda
- Fondo
2. Detección
de las señales
objetivo
- Vista general del
tejido
- Profundidad de
enfoque
3. Adecuación
de los núcleos
- Selección de
núcleos
3. Adecuación de los núcleos
Obtenga una vista general de la zona con hibridación mediante un objetivo de 20X:
• Selección de núcleos: localice la zona objetivo de interés (células
tumorales identificadas mediante la tinción H&E). Evite aquellas zonas en
las cuales los bordes nucleares no son claros y las células necróticas.
• Además, también deben ignorarse las señales con una baja intensidad
e inespecíficas, el ruido de fondo o la contratinción insuficiente para
determinar el borde nuclear. Solo deben enumerarse aquellos núcleos con
señales discretas.
4. Enumeración de las señales
• Vista general del tumor: escanee las distintas zonas de las células
tumorales para detectar una posible heterogeneidad, mediante un objetivo
de 40X. Evite aquellas zonas objetivo en las cuales las señales son débiles
y seleccione una zona con una correcta distribución nuclear.
• Recuento: empiece el análisis por el cuadrante superior izquierdo de
la zona seleccionada y, escaneando de izquierda a derecha, cuente el
número de señales dentro del límite nuclear, con un objetivo de 100X,
según las directrices suministradas a continuación y en la figura 1.
• Localice todas las señales presentes en el núcleo enfocando hacia arriba
y hacia abajo (eje Z).
• Considere dos señales con la misma forma y separadas por una distancia
igual o inferior al diámetro de la señal como una única señal.
• Los núcleos con dos señales o con señales de solo un color no deben
puntuarse. Puntúe únicamente aquellos núcleos con una o varias señales
de FISH de cada color.
• Cuente el número de señales HER2 y el número de señales CEP17 para
cada núcleo. Alterne entre los juegos de filtros naranja (HER2), verde
(CEP17), verde/naranja y DAPI/verde/naranja para visualizar ambos
colores, si es necesario.
4. Enumeración
de las señales
- Vista general del
tumor
- Recuento