Hoefer PR625 Immunoblot - Manual (Página 18)

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Apéndice B: Detección
utilizando ECL Western Blot
los sistemas de detección
Hoefer le recomienda que realice el etiquetado
y la detección de manchas de acuerdo con las
instrucciones que aparecen en el etiquetado
de Western Blot y un kit de detección. A
continuación se muestra un protocolo general
basado en el de GE Healthcare (anteriormente
Amersham Biosciences), ECL Western Blotting
Kit de detección.
Hay varios ECL Western Blot sistemas de detec-
ción disponibles.
El siguiente protocolo general se sugiere:
1
Después de la electroforesis y la transferencia de
proteínas separadas a nitrocelulosa o PVDF (bajo
Hybond LFP fluorescente para mayor sensibilidad) de
la membrana, bloquear los sitios no específicos con
una solución adecuada de bloqueo.
2
El bloqueo es seguido por dos lavados rápidos en
PBS/0.1% de Tween (PBS-T).
3
Sumergir e incubar la membrana con un anticuerpo
primario antígeno-específica de concentración
optimizado.
4
Quitar la membrana con dos lavados rápidos de PBS-T
seguido por 2 lavados más largos (2 × 5 minutos
con balanceo).
5
Incubar la membrana con una concentración óptima
del anticuerpo secundario conjugado.