Hoefer PR625 Immunoblot - Manual (Página 15)

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Paso 2.
Después de que los geles son borrados, las bandas en
la membrana no son visibles. Adición de un colorante
no reactivo hará que sea fácil para alinear la membrana.
Esto puede hacerse en una de dos maneras:
A. Para cargas de proteínas más grandes (>250 ng)
Ponceau S se pueden utilizar para teñir las proteínas
de forma reversible en la membrana después de la
transferencia electroforética.
Enjuague la membrana brevemente en agua y las
manchas en un 0,2% Ponceau S por 1 a 2 minutos,
luego destain en varios cambios de agua destilada hasta
que las bandas rojas aparecen sobre un fondo blanco.
Puesto que la mancha se pierde durante la etapa
subsiguiente de bloqueo, bandas de proteínas se debe
marcar en esta etapa con agujeros o con un lápiz punti-
agudo. La transferencia también puede ser fotocopiada.
Manchas teñidas Ponceau S se pueden almacenar
durante meses a 4 °C, se mantuvo húmeda entre las
hojas de parafina o tampón saturado de papel de
filtro. Borrones también puede congelarse en una
bolsa de plástico.
Polvo Ponceau S se debe disolver en agua destilada
para obtener una solución de trabajo. La solución se
puede reutilizar para varias semanas o meses, depen-
diendo del número de manchas membranas.
B. Para cargas de proteínas menores (<250 ng),
verde de metilo, Y pironina o Deep Purple puede ser
utilizado para marcar permanentemente la parte supe-
rior e inferior del gel para la alineación posterior con
los ImmunoBlot canales.
Al cargar el gel, añadir aproximadamente 5 µl de verde
de metilo (0,1% de solución en 50% de glicerol) o
pironina Y (0,05% de solución en glicerol al 50%) a
los carriles deseados. Estos colorantes migran justo por
delante del frente de colorante azul de bromofenol en
el gel, y transferirá permanentemente a la membrana.
Una segunda alícuota del colorante añadido al gel
cerca del final de la electroforesis entrará en el gel
de resolución dentro de 5 a 10 minutos y sirven para
marcar la parte superior del gel. Por favor, tenga en
cuenta que estos tintes fluorescentes pueden interferir
con los métodos de detección de Western Blot y por lo
tanto, debe ser removido antes de la imagen. Si se deja
sobre la membrana que dará lugar a señales no especí-
ficos en la detección fluorescente de Western Blot.